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利用免培养法对浓香型白酒曲药细菌菌群的解析研究

利用免培养法对浓香型白酒曲药细菌菌群的解析研究

发布日期:2018-05-23 作者: 点击:

浓香型白酒的生产过程实际上包含了一个庞大的微生物区系的复杂代谢过程。这个庞大微生物区系的微生物来源主要是窖泥和曲药,这两者是糟醅微生物区系形成的基础。细菌是曲药微生物的重要组成部分,曲药中细菌的构成及其衍变情况对浓香型白酒的酒体风格的形成有重要影响。长期以来,由于受到科研力量分散以及研究方法单一等限制,广大科研工作者对曲药的研究和认识还非常有限。 


浓香型白酒曲药.png


本研究选取的来自泸州老窖股份公司的中高温曲药块,每块曲粉碎混匀为混合曲样。以混合曲样作为分析对象。由于曲药组成成分复杂,本研究经过多次试验摸索,最后采用的是机械破碎法(玻珠破碎法)、酶处理法和表面活性剂处理相结合的方法成功提取到曲药中细菌的总DNA,然后对细菌的16S rDNA序列进行PCR扩增,利用纯化后的PCR扩增产物建立基因组文库,通过连接、转化、筛选阳性克隆等一系列步骤,测得曲药中细菌16S rDNA的近全序列。最后对曲药微生物进行了克隆分析、同源性比较和建立系统发育树,从而对曲药中不可培养细菌类微生物的构成有了更新的认识。 利用免培养法取得的研究结果表明:在对曲药中细菌的分析中,共发现hj01代表的Uncultured beta proteobacterium(AJ318110.1)紫细菌群(蛋白菌或变形杆菌),hj03代表的Comamonas cf acidovorans(AF181575.1)和Delftia acidovorans(AB020186.1)食酸丛毛单胞菌,hj02代表的Uncultured bacterium(ABl76235.1)不可培养杆菌,hj07代表的Dysgonomonas变形菌属mossii(AJ319867.2),hi04代表的Uncul tured Bacteroidetesbacterium(AJ318110.1)不可培养拟杆菌类群,hj06代表的Dysgonomonaswimpennyi(AY643492.1),hj05代表的Delftia tsuruhatensis(AY899912.1),hj12代表的Pseudomonas sp.(AJ704794.1)假单孢菌属,hj11代表的Arthrobacter sp.(AJ810897.1)节杆菌属以及hj13代表的Nocardiopsis sp.(AM236241.1)拟诺卡氏属。 其中,Delftia acidovorans,Dysgonomonas mossii,Dysgonomonaswimpennyi,Uncultured Bacteroidetes bacterium,Delftia tsuruhatensis,Arthrobacter sp., Nocardiopsis sp.等多个细菌类群在白酒糟醅及曲药中的发现尚未见有关报道。 系统发育分析结果表明,在进化树上,Uncultured beta proteobacterium,Comamonas cf.acidovorans/Deiftia acidovoraDs. Encultured bacterium这四大菌群的亲缘关系比较近,Dysgonomonas mossii,Uncu]turedBacteroidetes bacterium和Dysgonomonas wimpennyi这三大菌群的亲缘关系比较近,Delftia tsuruhatensis,Pseudomonas sp.和Arthrobacter sp.以及Nocardiopsis sp.的亲缘关系比较近。而这三大类分别属于不同的分支,相互之间亲缘关系也比较远,表明曲药中的细菌有着很高的生物多样性。 


从以上鉴定到的细菌类群来看,与已有的研究报告有一定的相似性,也有一定的差异性。相似性表现在,已有研究报告中利用传统的细菌分类方法都检出曲药中假单孢菌属为其优势菌,本次研究应用免培养法也检出假单孢菌。而微生物区系研究结果的差异性表现在很多方面,比如一些学者通过常规方法所鉴定到的大曲中常见的乳酸菌,醋杆菌等,免培养法却没有鉴定出相关菌种。大曲生产是传统工艺,自然培菌,网罗和富集环境中的微生物。而环境中的微生物种类和数量受自然地域条件的影响。我国地域辽阔,环境、气候千差万别,生产的大曲质量也不稳定。这些估计与各酿酒厂的地理气候及土质、曲药生产工艺差异以及实验方法不同等诸多因素有关。特别是利用分子生物学分析获得的一些在微生物分类学上尚未定性以及一些在常规分析鉴定方法中尚未被报道的细菌微生物菌系,其在曲药中的地位和作用,尚有待作进一步的研究。

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